实验室常见的灭菌消毒方法大全
2020-01-31 12:09
一、消毒和灭菌的区别
1、消毒（disinfection in hospital）：杀灭或消除医院环境中媒介物上污染的病原微生物的过程.
2、灭菌(sterilization)：杀灭或去除外环境中媒介物携带的一切微生物的过程.包括致病微生物和非致病微生物,也包括细菌芽胞和真菌孢子.灭菌是个绝对的概念,灭菌后物品必须是完全无菌的.即灭菌保证水平为106.
二、高温灭菌法
高温灭菌法是利用高温使微生物的蛋白质及酶发生凝固或变性而死亡，是应用最广泛且有效的灭菌方法。主要用于器械、容器、试剂等灭菌。
（一）高压蒸气灭菌法
图为实验室常用的高压灭菌锅 （右图来自《微生物实验》一书）
用高温加高压灭菌，不仅可杀死一般的细菌，对细菌芽胞也有杀灭效果，是最可靠、应用最普遍的物理灭菌法。主要用于能耐高温的物品，如金属器械、玻璃、橡胶、耐高温塑料制品及试剂的灭菌。高压蒸气灭菌器的类型和样式较多，如：①下排气式压力蒸气灭菌器是普遍应用的灭菌设备，压力升至102.9kPa，温度达121～126℃，维持20～30分钟，可达到灭菌目的。②脉动真空压力蒸气灭菌器已成为目前最先进的灭菌设备。灭菌条件要求：蒸气压力205.8kPa，温度达132℃以上并维持10分钟，即可杀死包括具有顽强抵抗力的细菌芽胞在内的一切微生物。
湿热灭菌是目前实验室使用最为广泛，灭菌效果最佳的方法。目前湿热灭菌的仪器技术上也非常成熟，安全系数较高。
高压蒸气灭菌的注意事项：
包裹的物品不宜太大，一般应小于30cm×30cm×50cm，大于该尺寸需要酌情延长灭菌时间；
1.高压锅内的包裹不要排得太密，以免妨碍蒸气透入，影响灭菌效果；
2.对塑料制品不宜放置过于拥挤，以免发生形变；
3.压力、温度和时间达到要求时，指示带上和化学指示剂即应出现已灭菌的色泽或状态；
4.锐性器械，如刀、剪不宜用此法灭菌，以免变钝；
5.瓶装液体灭菌时，如有塑料瓶盖要适当旋松瓶盖，并用牛皮纸或纱布包扎瓶口；如有橡皮塞时，应插入针头排气，切记要保持瓶内外的连通，防止高温膨胀爆裂；
6.注明灭菌日期和物品保存时限，一般可保留1～2周；
7.应有专人负责，每次灭菌前，应检查安全阀的性能，以防压力过高发生爆炸，保证安全使用。
（二）干热灭菌法
灭菌条件为：160℃维持2小时；170℃维持1小时；180℃维持30分钟；高温下可达灭菌要求。适用于易被湿热损坏和在干燥条件下使用更方便的物品（如金属、玻璃、陶瓷及凡士林纱布条等）灭菌。由于其对烤箱要严格要求（国内产的烘箱质量都有点悬），且大功率、高温下危险系数较大，一般不建议使用！特殊情况下，如需要灭活器械、容器中对于温度超级稳定的RNase时，才考虑使用（其实也可以DEPC预处理器械、容器、溶剂等，然后湿热灭菌！）。
干热灭菌法的注意事项：
1.对灭菌对象的理化性质有一定了解，明确对象在高温下的稳定性；
2.对设备的情况、参数有清醒认识，了解设备的温度设计上限；
3.专项供电，确保接入电路足够负荷；
4.灭菌过程中，相关人员要实时在岗监管，不得离岗，如遇特发情况及时切断电源！
三、过滤除菌法
过滤除菌法（Sterilization byfiltration） 是用物理阻留的方法将液体或空气的细菌除去，以达到无菌目的。常用于对热不稳定液体试剂的灭菌。一般来说孔径为0.22μm的微滤膜即可有效地去除微生物达到除菌的目的，但该孔径下无法去除体积极小的支原体或病毒颗粒。因此如果需要去除这些物体，就需要使用孔径更小的纳滤膜(孔径可达20 -50nm )。
由于滤膜孔径的大小和过滤的流速呈反比，因此我们通常在小孔径滤膜之前使用大孔径的滤膜进行预过滤，从而防止微孔被过早的堵塞，保证过滤通畅进行，进而获得更高的得率。
在过滤除菌过程中要求过滤装置和滤膜自身必须无菌。因此我们可以选择购买已经无菌预处理的一次性使用装置（如Millipore的一次性针头滤器），也可以选择自行无菌处理，目前市售的滤膜通常可以采用高压灭菌法除菌。
注意事项：
在正式过滤前，必须进行过滤系统的密闭性和滤膜的完整性测试。过滤过程要在等级A的洁净室内进行（通常可在超净台完成）。
四、紫外线灭菌
紫外线的定义是波长在10纳米到400纳米之间的电磁辐射。不过在实际应用中，使用的波长一般在100纳米以上。波长在315到409纳米之间的UVA通常可以把皮肤晒黑，波长280到315纳米的UVB可以灼伤皮肤并增加皮肤癌风险，波长在200到280纳米的UVC可以有效地杀灭细菌和病毒，而波长在100到200纳米之间的紫外线会被空气中的氧气吸收，所以只能在真空中或者至少是完全无氧的环境里工作，也就不适合用于现实杀菌了。传统的紫外杀菌选用254纳米的波长。
从左到右分别是X-射线、紫外光。可见光、红外光，光的波长依次递增。常用的杀菌波长254纳米位于紫外光中远紫外线（UVC）波段。图片来源：tecnowattsnc.it
当紫外线被细菌或者病毒吸收之后，就会破坏DNA，从而使它们失去增殖能力。就杀菌结果而言，跟加热或者用化学物质处理是一样的。
紫外杀菌的能力除了跟波长有关，还取决于灭菌物被辐射到的能量。在选定的254纳米波长下，杀菌效果跟能量强度呈现一个拉伸过的S型。也就是说，在低能量下，杀菌效果很差，这是因为细菌或者病毒跟人体一样，对于DNA损伤有一定的修复能力。在照射能量低的时候，损伤的DNA被及时修复，细菌和病毒就能够继续增殖下去。当能量高到一定程度，DNA修复系统实在忙不过来了，DNA损伤急剧增加，宏观上表现出来就是细菌或病毒被“杀死”了。超过这个能量强度，每增加一点，灭菌能力都会大大增加。但是增加到一定程度，就进入第二个平台——再继续增高能量，杀菌效果增加得也很少。这个灭菌效果上的“尾巴”可能是源于一部分微生物对于紫外线攻击很顽强，也可能源于有一部分被处理样品无法被照射到。
因为这个“尾巴”的存在，紫外杀菌难以实现加热或者化学杀菌剂那么彻底的杀灭。通常把降低4个对数值作为“灭菌标准”，也就是还有万分之一的细菌活下来。而鲜牛奶的巴氏杀菌——在72摄氏度下处理15秒——则通常是降低5个对数值，即最多只有十万分之一的细菌存活。如果降低的对数值是12个以上，几乎就没有细菌能够幸存了。
不同的微生物对紫外线的敏感性不同，有的在较低能量强度下就会被大量杀灭，而有的则需要更高能量才行。以降低4个对数值为标准，研究中检测过的细菌有的只需要每平方米几十焦耳的能量，有的则需要每平方米300焦耳以上。我们并不知道现实的食物中存在哪些细菌，又各有多少，所以总是把最顽强的那个作为目标，顺便把其他的灭了。因此，紫外杀菌所用的能量强度需要在每平方米400焦耳以上。
各种灭菌技术的灭菌效果都会受到灭菌物理化性质的影响。比如加热或者高压灭菌，温度、酸碱度和压力都会有很大影响。而在紫外灭菌中，这些因素就不那么重要。紫外杀菌的关键是紫外线能够达到细菌，所以穿透性是关键。诸如灭菌物的组成、固体含量、颜色等因素都会影响紫外线的吸收，从而影响它穿透的厚度，也就对杀菌效果有很大的影响。如果灭菌物均一、透明，紫外线的穿透性好，灭菌效果就会好；反之，如果灭菌物浑浊，那么紫外线就会被散射，能量在穿透中降低，灭菌效果就会比较差。
总的来说，紫外线的穿透能力比较差，通常也就能穿透两三厘米的厚度。但如果用在某些物质短时间灭菌，效果还是很好的。
注意事项：
1.选择紫外灯时，应该仔细核对型号、适用范围和注意事项。不要进入开启紫外消毒灯的室内。千万不要对着消毒灯验钞或者观察荧光，任何时候都不应该直视紫外灯管。紫外灯应该尽可能只在封闭空间内小范围使用，并避免不必要的暴露
2.在使用过程中，应保持紫外线灯表面的清洁，一般每两周用酒精棉球擦拭一次，发现灯管表面有灰尘、油污时，应随时擦拭。
3.用紫外线消毒物品表面时，应使照射表面受到紫外线的直接照射，且应达到足够的照射剂量
五、化学消毒灭菌
（1）浸泡法 选用杀菌谱广、腐蚀性弱、水溶性消毒剂，将物品浸没于消毒剂内，在标准的浓度和时间内，达到消毒灭菌目的。
（2）擦拭法 选用易溶于水、穿透性强的消毒剂，擦拭物品表面，在标准的浓度和时间里达到消毒灭菌目的。
（3）薰蒸法 加热或加入氧化剂，使消毒剂呈气体，在标准的浓度和时间里达到消毒灭菌目的。
适用于室内物品及空气消毒或精密贵重仪器和不能蒸、煮、浸泡的物品（血压计、听诊器以及传染病人用过的票证等），均可用此法消毒。
（4）喷雾法 借助普通喷雾器或气溶胶喷雾器，使消毒剂产生微粒气雾弥散在空间，进行空气和物品表面的消毒。
（5）环氧乙烷气体密闭消毒法 将环氧乙烷气体置于密闭容器内，在标准的浓度、湿度和时间内达到消毒灭菌目的。
环氧乙烷是广谱气体杀菌剂，能杀灭细菌繁殖体及芽胞，以及真菌和病毒等。穿透力强，对大多数物品无损害，消毒后可迅速挥发，特别适用于不耐高热和温热的物品，如精密器械、电子仪器、光学仪器、心肺机、起博器、书籍文件等，均无损害和腐蚀等副作用。本品沸点为10.8℃，只能灌装于耐压金属罐或特制安瓿瓶中。
注意事项
1.易燃易爆品存放在阴凉、通风、无火源、无电开关处。用时轻取轻放，勿猛烈碰撞。2.消毒时，应注意环境的相对湿度和温度。钢瓶需加温时，热水不可超过70℃。
3.对皮肤、眼及粘膜刺激性强的液体，如有接触，立即用水冲洗。
4.在有毒气体消毒的操作过程中，如有头昏头痛等中毒症状时，应立即离开现场，至通风良好处休息。
六、火焰灭菌
是指用火焰直接烧灼的灭菌方法。该方法灭菌迅速、可靠、简便，适合于耐火焰材料（如金属、玻璃及瓷器等）物品与用具的灭菌，不适合药品的灭菌。
最常见的火焰灭菌，酒精灯。
图为加热接种环。（图片来源：《接种、分离纯化和培养技术》）
注意事项：
1、酒精灯的灯芯要平整.
2、添加酒精时,不超过酒精灯容积的2/3；酒精不少于1/4.
3、绝对禁止向燃着的酒精灯里添加酒精,以免失火.
4、绝对禁止用酒精灯引燃另一只酒精灯.
5、用完酒精灯,必须用灯帽盖灭,不可用嘴去吹.
6、不要碰倒酒精灯,万一洒出的酒精在桌上燃烧起来,应立即用湿布扑盖.
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